PBMC的分离制备方法--

文章来源:贵州省人民医院中心实验室 作者:中心实验室 发布时间:2012年11月14日 点击数:1,340 字号:

[导读]细胞制备 从全血或白膜层细胞中分离外周血单个核细胞的流程   注意:所有血液操作步骤必须在二级生物安全柜中进行 目的:分离红细胞和外周血单个核细胞 材料: 手套和隔离衣 RPMI FBS胎牛血清 50ml离心管 5ml,10ml和25ml移液管 移液球 离心机 Ficoll-Paque Plus分离液 血球计数板 生理盐水 1XPBS 注射器 混匀管   方法: 1)  将血样放进50ml塑料离心管中,每管大约15-20ml,然后用生理盐水稀释一倍(总体积不超过40ml以给Ficoll留一定的空间)。 2)  轻轻的将全血用消毒注射器加到10ml Ficoll-Paque的上层,注意保持液面清晰。 3)  将试管在21 ℃ 1000rpm 离心至少30分钟。减速时不要使用刹车,否则可能破坏分层。 4)  吸取上层15ml血浆,如果没有别的用途可以丢弃。用10ml移液管收集分层处的细胞,移入新的50ml离心管。加入50ml生理盐水清洗细胞。 5)  于10℃,在1500rpm离心5分钟。 6)  吸弃上清,轻轻敲打试管底部拍散沉淀,然后加入新鲜生理盐水至50ml清洗细胞。如果有好几管细胞,将它们在最后一次清洗时合并到一管,加入生理盐水至50ml。按第5)步条件离心。按这种方法洗涤细胞三遍。 7)  在最后一遍离心前从50ml细胞悬液中吸取10ul,用血球计数板进行细胞计数。 当使用BUFFY COAT(BC)白膜层细胞分离PBMC时: 1)  先用酒精喷洒收集袋或收集管进行消毒,然后将BC分别加入4个50ml塑料离心管中(通常每管10-15ml)。在每管中加入生理盐水稀释达到40ml。将这一细胞悬液轻轻加到10ml Ficoll 的上层,注意保持液面分层清晰。 2)  按以上全血分离的方法进行离心。 3)  收集分层处的细胞(可能会有很厚的细胞层)。 4)  清洗细胞三次,每次1500rpm离心5分钟。最后一次清洗前将细胞合并到一管。 5)  进行细胞计数并将外周血单个核细胞用含1%FCS的PBS400ul重悬细胞。

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